Egy gombaspecifikus protein foszfatáz funkcionális doménjeinek expressziójára alkalmas vektorok előállítása

Munkám célja a Candida albicans protein foszfatáz Z (CaPpz1) nevű enzim regulációs lehetőségeinek felderítése. A CaPpz1 az új típusú protein foszfatázok közé tartozik, és fontos szerepet játszik az ionháztartás fenntartásában, a sejtfal bioszintézisében és a sejtciklus szabályozásában. Munkacsoportunk nemrég kimutatta a hifa növekedésben, a fertőzőképességben és az oxidatív stresszben játszott szerepét is. A CaPpz1 két doménből áll: a C-terminális, katalitikus domén az enzim aktivitásáért felel, míg a rendezetlen szerkezetű N-terminális régió a regulációban játszik szerepet. Más fajokkal összehasonlítva a katalitikus domén jelentős mértékben-, míg a szabályozó rész kevésbé konzerválódott az evolúció során.
Kísérleteimben in vitro mutációk kialakításával kívántam megvizsgálni a fehérje régiók szerkezete és az enzimaktivitás összefüggését. Ennek érdekében két His6-cimkével ellátott deléciós mutánst hoztam létre, amelyek alkalmasak az N- és a C-terminális domének külön-külön történő expresszálására. Az N-terminális domént kódoló DNS szakaszt PCR segítségével amplifikáltam, a pET28a(+) vektorba ligáltam, és Escherichia coli DH5α törzsbe transzformáltam. A C-terminális, katalitikus domén termeltetése más stratégia szerint történt mivel a pET28a(+) vektorba történő ligálást nem sikerült megoldani. A megfelelő PCR terméket ezért először a pGEM-T-Easy segédvektorba klónoztam, majd kivágtam és a pET42a(+) expressziós vektorba illesztettem, végül Escherichia coli DH5α törzsbe transzformáltam. A konstruktokat DNS szekvenálással ellenőriztem, és azt találtam, hogy megfelelnek a terveknek, azaz alkalmasak a funkcionális domének expressziójára.
A továbbiakban azt tervezzük, hogy a két konstruktot Escherichia coli BL21 (DE3)-RIL baktériumtörzsbe transzformáljuk, expresszáltatjuk és affinitás kromatográfiával tisztítjuk a CaPpz1 két doménjét. Ezután megmérjük a rekombináns C-terminális domén és a korábban már termeltetett teljes hosszúságú CaPpz1 foszfatáz aktivitását és azt is ellenőrizzük, hogy az N-terminális domén hozzáadása milyen mértékben befolyásolja a katalitikus domén illetve a teljes hosszúságú enzim aktivitását.