HIV-2 Proteáz Biokémiai és Kinetikai Karakterizációja

A Humán immundeficiencia vírus 2 az AIDS betegség kialakulásáért felelős vírus, mely főleg Nyugat-Afrikában fertőz. A vírus életciklusához 3 fő enzim szükséges: reverz transzkriptáz, integráz, proteáz.A proteáz a megfelelő poliprotein láncok elhasítása révén aktiválja a vírust, így létrehozva a fertőzőképes patogént.
Munkánk során vad típusú HIV-2-höz hasonló kodon-optimalizált proteáz szakaszt CGP vektorba klónoztuk T4 DNS, illetve “Quick” DNS Ligációs reakciók segítségével. A proteáz már eredetileg a pET11-a expressziós vektorban volt, melyet szekvenálási PCR módszerrel, illetve restrikciós hasításokkal ellenőriztünk. A konstruktot expresszáltattuk, majd a termelődött fehérjét kromatográfiás módszerrel tisztítottuk meg. A proteáz aktivitását a HIV-2 proteáz természetes hasítási helyével analóg szekvenciájú szintetikus oligopeptid szubsztráton HPLC-s módszer segítségével igazoltuk. Az in vitro kísérletekben a proteáz klinikumban is használatos inhibitoraival (indinavir, nelfinavir) végeztük a gátlási teszteket HPLC-s módszer segítségével.
Továbbá az autoproteolitikus degradációs esszé segítségével vizsgáltuk az enzim aktivitásának időfüggését is.
A klónozott konstrukt fertőzőképességének bizonyítására human 293FT sejtvonalat használtunk fel. In vivo kísérletünk során a 293FT sejteket transzfektáltuk, majd a termelődött vírus koncentrációját Reverz Transzkriptáz ELISA módszerrel határoztuk meg. Továbbá a termelt vírust transzdukáltuk, szintén 293FT sejtekbe, majd a vírus fertőzőképességét bizonyítottuk áramlási citométerrel.
In vitro kísérleteink során kapott eredményeink azt mutatják, hogy az indinavir, mint proteáz gátló jelentősebben csökkentette az enzim aktivitását a nelfinaviréhoz képest.