Alfavírus proteáz szubsztrátok helyspecifikus mutagenezisére és expressziójára alkalmas rendszer optimalizálása

Az alfavírusok a togavírusok családjába tartozó, burokkal körülvett mRNS vírusok, melyek állatállományok és az emberek körében is okoznak fertőzéseket, szerte a világon. Kiválthatnak agyhártyagyulladást, valamint hozzájárulhatnak kóros ízületi gyulladás-szerű tünetek kialakításhoz is. Életciklusukban központi szerepet játszik egy nem-szerkezeti fehérje (nsP2), mely proteolitikus aktivitással rendelkezik. Laboratóriumunk már tanulmányozta három alfavírus családból származó nsp2 proteáz aktivitását oligopeptid szubsztrátokon. Megállapítottuk, hogy a vad típusú nsp2 proteázok az eredeti szubsztrátokon csak kis aktivitással rendelkeznek. Célunk egy olyan enzim-szubsztrát pár kiválasztása volt, amely alkalmas lehet biotechnológiai felhasználásra, ezen kívül a kísérletek során gyűjtött információk fontosak lehetnek antivirális terápia kidolgozásához is. Annak érdekében, hogy előnyösebb szubsztrátokat azonosíthassunk, egy olyan rekombináns fehérjét terveztünk, mely alkalmas lehet a szubsztrátok fúziós formában történő expressziójára és módosítására. A konstrukcióban az oligopeptid szubsztrát N-terminális végénél egy hat hisztidines szekvenciát követően egy maltózkötő fehérje van, a fehérje tisztításának megkönnyítésére és oldékonyságának megnövelésére. A C-terminális véghez egy fluoreszcens fehérjét kapcsoltunk, ezáltal megkönnyítve a detektálást. A szubsztrátszekvenciák kicserélése a konstrukcióban, egy restrikciós kazettában lehetséges. Az expressziós plazmid, mérete miatt (>8Kb) nem megfelelő a szubsztrátszekvenciák random mutagenezissel történő módosítása, ezt egy kisebb, mutagenezisre alkalmasabb plazmidban végeztük. Az így módosított szubsztrátszekvenciát restrikciósan kihasítjuk a mutagenizált plazmidból és az expressziós plazmid restrikciós kazettájába inzertáljuk. Ezen tanulmányban kívánjuk részletesen bemutatni az optimalizált rendszert, valamint bizonyítani, hogy ez a fúziós forma megfelelő-e a módosított alfavírus szubsztrátok termelésére.