Kísérlet a XIII-as véralvadási faktor izopeptidáz és transzamidáz aktivitásainak szeparálására

A XIII-as véralvadási faktor (FXIIIA) a transzglutaminázok családjába tartozik, és fő feladata a fibrin alvadék stabilizálása kalcium-függő transzamidáz aktivitása révén. Ennek során glutamin és lizin oldalláncok között képez izopeptid kötést, amelyet izopeptidáz aktivitásával képes hasítani is. Így szabályozó szerepet tölt be a fibrinolízisben is. Korábban a transzglutamináz 2 (TG2) vizsgálata során olyan mutánsokat készítettünk, amelyek vagy transzamidáz (T), vagy izopeptidáz (I) aktivitással rendelkeztek. A transzglutamináz enzimcsalád igen konzervált és a FXIIIA nagyfokú szekvencia és strukturális hasonlóságot mutat a TG2-vel. Ezért célul tűztük ki a homológ mutációk hatásának vizsgálatát a FXIIIA transzamidáz és izopeptidáz aktivitásaira, mivel ez jelentőséggel bírhat a nem kívánt véralvadás esetén a fibrinolízis elősegítésében.
Ennek érdekében az enzimet pEV bakteriális expressziós vektorba klónoztuk NdeI/XhoI restrikciós helyre, amely N-terminálisan TEV proteázzal lehasítható (His)6 véggel rendelkezik, majd hely-specifikus mutánsokat készítettünk. A klónozás és a mutagenezis eredményességét restrikciós hasítással, szekvenálással és próbatermeléssel erősítettük meg. A fehérjéket Ni-NTA affinitás kromatográfiával tisztítottuk, majd kinetikus izopeptidáz és transzamidáz aktivitásmérési módszerekkel vizsgáltuk. Mivel a FXIIIA preparátum termelése és tisztítása kevésbé volt hatékony a TG2-höz képest, így ezek optimalizálására is szükség volt, ami arra utal, hogy a transzglutamináz enzimcsalád nagyfokú hasonlóságának ellenére, a különböző transzglutaminázok optimális megtermelése eltérő expressziós rendszert igényel.
A TG2-T és -I mutánsok aktivitásaival ellentétben, a FXIIIA-T mutáns emelkedett transzamidáz és hasonló izopeptidáz aktivitást mutatott, míg a FXIIIA-I mutáns mindkét aktivitása jelentősen csökkent a vad típusú FXIIIA enzimhez képest. Ez arra utal, hogy az egyes transzglutaminázoknál a különböző típusú transzglutamináz aktivitások egymáshoz viszonyított egyensúlyának szabályozásában az aktív helyet körülvevő aminosavaknak eltérő szerepe lehet. További mutánsok tesztelését tervezzük célunk elérése érdekében.