Alpha2-plazmin inhibitor meghatározása könnyben

Az alpha2-plazmin inhibitor (alpha2-PI, alpha2-antiplazmin) egy májban szintetizálódó, kb. 67 kDa molekulatömegű plazmafehérje, amely a szabad plazminnal (szerin-proteáz) történő gyors komplexképzés révén (PAP komplex) gátolja a fibrinolízis plazminos reakcióútját. Ezen felül az aktivált XIII-as faktor hatására a fibrin láncokkal keresztkötéseket képez, és akadályozza a plazminogén proenzim kötődését a fibrinhez, ezáltal hatékonyan gátolja az alvadék lízisét. Korábban már kimutatták a XIII-as faktor jelenlétét a plazmán kívül más testfolyadékokban, így például a humán könnyben is. Az alpha2-PI fehérje és mRNS jelenlétét a humán corneában igazolták, a fehérje mennyiségét azonban a könnyben és a corneában megfelelően érzékeny módszer hiányában eddig nem vizsgálták.
Munkám során célul tűztem ki az alpha2-PI plazma koncentrációjának mérésére korábban kidolgozott szendvics ELISA módszer érzékenyítését abból a célból, hogy a meghatározás kis mennyiségű könnymintából is lehetővé váljon, valamint a kidolgozott módszer jellemzését, egészséges személyek nem stimulált és stimulált könnymintáiból az alpha2-PI totál proteinre vonatkoztatott koncentrációjának meghatározását.
A torma peroxidáz enzim kromogén szubsztrátja helyett kemiluminescens szubsztrát alkalmazásával sikerült a módszer érzékenységét fokozni (detektálási határ: 0.27 ng/ml alpha2-PI). Csökkentett reakciótérfogatot és 20x-os mintahígítást alkalmazva 6 microliter mintából a totál protein és az alpha2-PI koncentráció is meghatározható. A módszer reprodukálhatósága megfelelőnek bizonyult, a sorozaton belüli variabilitás 181 ng/ml és 19,7 ng/ml koncentrációjú minták esetén 4,97% ill. 6.7% és a sorozatok közötti variabilitás sem haladta meg a 10 %-ot. 42 egészséges önkéntes nem stimulált és stimulált könnymintáiból 0,88 (0,34-3,3) ng alpha2-PI/mg TP ill. 0,6 (0,08-4,64) ng alpha2-PI/mg TP mennyiséget mutattam ki.
A kidolgozott módszer a továbbiakban lehetővé teszi az alpha2-PI szint változásának követését különböző patológiás folyamatokban, valamint a corneális plazmin aktivitás szabályozásában betöltött szerepének vizsgálatát.