Intraventricularis mikroinjekció és elektroporáció alkalmazása a gerincvelői hátsó szarv fejlődésének vizsgálatában patkányembriókban

Az in utero elektroporáció (IUE) az embriófejlődés vizsgálatának egy korszerű és hatékony módja, amely olyan állatfajok esetén is sikerrel alkalmazható, amelyek esetén a transzgenikus állatok létrehozása technikai korlátokba ütközik. Az eljárás során DNS vektort tartalmazó oldatot mikroinjekcióval adunk be élő embriókba az uterus falán keresztül, amelyet az ott levő sejtek elektroporációt követően vesznek fel és bennük a vektor által kódolt gén kifejeződik.
Az idegrendszerben először japán kutatók, Saito és Nakatsuji (2001) illetve Tabata és Nakajima (2001) használták egérembriók nagyagyfejlődésének vizsgálatához, melyet később patkányokon is sikeresen alkalmaztak (Walantus és mtsai., 2007).
Munkánk célja volt kidolgozni az IUE módszerét a patkányokban a gerincvelői hátsó szarv neuronhálózatainak kialakulását célzó vizsgálatokra. A kísérletekhez időre pároztatott patkányokat használtunk fel, és a műtéteket mélyaltatásban a vemhesség 14,5 – 16,5 napjain végeztük. A hasfalon történő sagittalis metszést követően, a terhes uterus-szarvakat a hasüregen kívülre preparáltuk. Az embriók folyamatos nedvesen tartása mellett lokalizáltuk azokon a IV. agykamrát, majd abba egy szájpipettához rögzített kapillárison keresztül pmaxGFP vektort tartalmazó DNS oldatot injektáltunk, amely diffúzióval a canalis centralisba is lejutott. Az embriók elektroporációját követően, az uterus hasüregbe történő visszahelyezése után, a műtéti sebet kétrétegű varratsorral zártuk. A túlélt embriókat 1-6 napos korban fixáltuk és azok agytörzsi és nyaki gerincvelői szakaszairól szövettani metszeteket készítettünk, majd a GFP-t kifejező idegsejteket fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk.
Az in utero kezelést követően az embriók mintegy 40 %-a élt túl, amelyek agytörzsi és a gerincvelő felső nyaki szegmentumaiban is GFP-t kifejező sejteket tudtunk kimutatni, bizonyítva ezzel az elektroporáció sikerességét. A gerincvelő felszínes zónájában már az elektroporációt követő első nap után is találtunk idegsejt morfológiával rendelkező sejteket. A jelölt sejtek morfológiájának és neurokémiai tulajdonságainak jellemzése jelenleg folyamatban van.