GFP és mCherry reporter gének kifejezése indukálható egér embrionális őssejtvonalakban

Szervezetünk kifejlődéséhez, állandó megújulásához, és működésének fenntartásához elengedhetetlenül szükségesek az őssejtek. Munkacsoportunk hosszútávú célja egér embrionális őssejt eredetű hemopoetikus sejtek transzkripciós programozása fejlődést szabályozó gének bekapcsolásával. Ehhez indukálható embrionális sejtvonalakat kívánunk létrehozni ahol a transzgén tetszőleges időpontban kapcsolható be. Ahhoz, hogy ennek a technológiának a működőképességéről meggyőződjünk elsőként reporter géneket (GFP, mCherry) kifejező sejtvonalakat hoztam létre, melyekkel nyomon követhető, hogy a sejtek hány százalékában és milyen intenzitással expresszálódik az adott transzgén. Ennek megvalósítása érdekében genetikailag módosított ZX.1 egér embrionális őssejteket használtam, melyet amerikai kollaborációs partnerünktől kaptunk. Ez a génexpressziós rendszer lehetővé teszi, hogy a tetraciklin egyes származékaival pl. doxiciklin hozzáadásával szabályozzuk a kromoszóma egy meghatározott helyére beépített transzgén kifejeződését. A vizsgálni kívánt reporter géneket Gateway klónozási technológiával integráltam egy olyan plazmidba (p2Lox) mely képes rekombinálódni a ZX.1 sejtek már előre genetikailag módosított régiójával (Cre mediált helyspecifikus rekombináció). Az GFP illetve az mCherry géneket hordozó vektorokat elektroporációval transzfektáltam a ZX.1 sejtekbe, majd Geneticin-nel (G418) szelektáltam a reporter géneket hordozó individuális kolóniákat. A létrehozott transzgéneket tartalmazó egér embrionális sejtkolóniák indukálhatóságát doxiciklin hozzáadásával teszteltük, fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatokkal és áramlási citometriával. Eredményeink szerint mind a GFP-t mind az mCherry-t hordozó sejtek indukálhatóak voltak ugyanakkor az indukció mértéke nagyon eltérő volt. Egyes sejtvonalak 80%-ban, míg mások csak 2-3%-ban mutattak doxiciklin hatására expressziót. Jelenleg azt tanulmányozzuk, hogy a hemopoetikus irányba átalakított sejtekben a reporter gének milyen mértében indukálódnak összehasonlítva az embrionális őssejt állapottal.