A RasGRP3 fehérje szerepének vizsgálata emlő-eredetű tumorokból származó mintákon és sejtvonalakon

A RasGRP3 a Ras-specifikus guanin nukleotid exchange faktorok (RasGEFs) közé tartozó RasGRP (Ras guanil nukeotid releasing peptid) család tagja. A RasGRP3 fehérje potenciális onkogén hatású molekula, már több rosszindulatú daganattípusban pl. prosztata adenocarcinomában és melanomában is leírták a fehérje génjének amplifikációját és a fehérjetermék overexpresszióját. A fehérjék ezen potenciális onkogén hatását figyelembe véve kísérleteink során a RasGRP3 kifejeződését és funkcionális szerepét vizsgáltuk az egyik legrosszabb indulatú daganattípusban, az emlő eredetű ductalis adenocarcinomában.
Kísérleteink során sikerrel igazoltuk a RasGRP3 fehérje (immunhisztokémia, Western Blot) és mRNS szintű (Q-PCR) jelenlétét humán, emlő-eredetű ductalis adenocarcinomából származó szöveti mintákon. Megállapítottuk, hogy míg a RasGRP3 jellemzően a sejtek citoplazmájában expresszálódik, addig a foszforilált forma markáns magreakciót mutat. Ezt követően primer (BT-474) és metasztatikus (MCF7, T-47D, SK-BR-3, MDA-MB-453) emlő tumoros sejtvonalakon mind mRNS, mind fehérje szinten (Q-PCR és Western blot) sikerült kimutatnunk a fehérje expresszióját. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy a primer sejtvonal RasGRP3 expressziójának mértéke kisebb, mint a metasztatikus társaié. Ennek alapján -a RasGRP3 funkcionális szerepét tisztázandó- virális transzfekciót felhasználva RasGRP3-géncsendesített tenyészeteket hoztunk létre az MCF7 és T-47D sejtvonalakon. MTT-alapú kolorimetriás assay segítségével megállapítottuk, hogy a RasGRP3 expresszió gátlása csökkentette a sejtek életképességét. Az életképesség csökkenésének hátterében álló lehetséges folyamatokat kvantitatív fluorimetriás mérésekkel vizsgálva kimutattuk, hogy a fehérje kifejeződésének gátlása szignifikánsan csökkenti a proliferáció mértékét (CyQuant assay), ugyanakkor nem vált ki sem apoptotikus, sem nekrotikus sejthalált (DilC/Sytox assay).
Eredményeink alapján feltételezhető, hogy a RasGRP3 fehérje aktivitása szerepet játszhat az emlő eredetű metasztázisok kialakításában és a sejtek növekedésének szabályozásában, felvetve a fehérje potenciális jelentőségét a fenti daganat esetleges terápiájában.