A TRPC6 ioncsatorna jelenlétének és funkcionalitásának vizsgálata egér és humán podocytákon

A TRPC6 (transient receptor potential canonical-6) egy nemspecifikus, főként kalciumra permeábilis ioncsatorna. Kimutatták, hogy a TRPC6 „gain-of-function” mutációja, illetve szerzett túlműködése fokális szegmentális glomerulosclerosishoz (FSGS) vezet, ami a krónikus veseelégtelenség egyik leggyakoribb oka. A folyamat részletei nem teljesen tisztázottak, ezért munkánk során célunk a TRPC6 expressziójának és funkcionalitásának vizsgálata volt egér és humán podocytákon.
Kísérleteink kezdetén optimalizáltuk az általunk használt podocyta sejtvonalak tenyésztési körülményeit. Első lépésként podocyta-specifikus markerek kifejeződését vizsgálva igazoltuk, hogy az általunk használt differenciáltatási protokollok megfelelőek, hiszen az egér és humán podocyták egyaránt expresszálták a specifikus podocyta markereket (podocin, alpha-actinin 4, synaptopodin) és a TRPC6-ot egyaránt (Western blot, immuncitokémia).
Funkcionális kísérleteinket a TRPC6 specifikus aktivátor 1-Oleoyl-2-Acetyl-sn-Glycerol (OAG) hatásainak vizsgálatával kezdtük, mely dózisfüggő intracelluláris Ca2+-szint-emelkedést okozott (Ca-imaging, Fluo-4 AM) a podocytákon. Az OAG „hatékony” koncentrációinak azonosítása után megvizsgáltuk a hosszabb távú (1, 2 és 3 napos) OAG kezelések hatását a sejtek életképességére. A kezelések hatására nem csökkent az élő sejtek száma (MTT assay), és nem indultak el sem apoptotikus, sem pedig nekrotikus folyamatok (kombinált fluoreszcens DilC1(5)-SYTOX Green jelölés). A jelenség hátterét vizsgálva megállapítottuk, hogy az OAG már rövidtávú (30 perc) előkezelés után is a csatorna deszenzitizációját okozta (Ca-imaging).
Eredményeink alapján megerősítést nyert, hogy az egér és humán podocyták funkcionálisan aktív TRPC6 csatornával rendelkeznek, és alkalmasak lehetnek a podocytopathiával járó betegségek molekuláris pathologiai hátterének vizsgálatára. A csatorna deszenzitizálódására utaló eredményeink alapján feltételezhető, hogy létezik egy endogén szabályozó mechanizmus, ami megvédi a sejteket a TRPC6 túlaktiválódásától. Ezen szabályozó rendszer pontos működésének megértése új távlatokat nyithat a TRPC6 és a podocytopathiával járó betegségek kapcsolatának leírásában.