A miozin foszfatáz szerepe a neurotranszmitter-kibocsátásban

A neurotranszmitterek felszabadulását a fehérjék reverzibilis foszforilációja is szabályozza. A neuronális fehérjék foszforilációs szintjét a protein kináz és foszfatáz enzimek határozzák meg, azonban a jelátviteli folyamatokban résztvevő enzimek és szabályozási mechanizmusuk még nem minden részletében ismert. A miozin foszfatáz (PP1M) protein foszfatáz 1 (PP1) katalitikus alegységet (PP1c) és miozinhoz is kötődő 133 kDa regulátor alegységet (MYPT) tartalmaz, és elsősorban citoszkeletális fehérjék szabályozásában játszik szerepet. Újabb vizsgálatok alapján azonban a PP1M inhibitorai jelentős mértékben befolyásolják a neurotranszmitter kibocsátást is, ami az idegrendszerben betöltött fontos szerepére utal. Ezért célul tűztük ki a PP1M enzim lokalizációjának, szabályozó- és élettani szerepének vizsgálatát a B50 neuroblasztóma sejtvonalon.
A PP1M alegységeinek és az enzimet gátló Rho-A aktivált kináz (ROK) jelenlétét kimutattuk B50 sejtekben Western blot analízissel és immunfluorszcenciás vizsgálatokkal. PP1M-re foszfospecifikus antitestekkel bizonyítotttuk, hogy az Y27632 (ROK inhibitor) csökkentette, míg a PP inhibitorok növelték a PP1M Thr 696 gátló foszforilációs hely foszforilációját. A PP aktivitásmérési kísérletek is alátámasztották, hogy a ROK gátolja, míg a PP enzimek aktiválják a PP1M-t.
Immunprecipitációval bizonyítottuk a MYPT asszociációját ROK-kal, a PP1c izoformáival, és a neurotranszmitter kibocsátásban kulcsszerepet játszó SNARE komplex elemeivel (SNAP25, szintaxin), valamint a szinapszinnal is. A ROK és a PP1M szubsztrátfehérjéinek azonosítására B50 lizátumban foszforilációs kísérletet végeztünk Y27632, és TMC (a PP1 inhibitor) jelenlétében. Sikerült bizonyítanunk a szinapszin Ser9, illetve a szintaxin Ser14 és a SNAP25 Ser189 aminosav-oldalláncon történő ROK/PP1 általi szabályozását is.
A PP1M kölcsönható- és szubsztrátfehérjék az axon elongációban, elaborációban, neurotranszmitter felszabadulásban és a szinaptikus vezikulumok szállításában játszanak szerepet, ami a PP1M és a ROK fontos szerepére utal a szinaptikus fehérjék foszforilációs szintjének kialakításában és a neurotranszmitter kibocsátás szabályozásában (OTKAK68416).