A membránpotenciál hatása a fehérjék mobilitására

A nyugalmi membránpotenciál egy 10^7 V/m nagyságrendű elektromos térerősségnek felel meg, ami befolyásolhatja a membránfehérjék konformációját és működését. Korábbi kutatásaink során kimutattuk, hogy mind az MHC glikoproteinek, mind a feszültségfüggő Kv1.3 K+-csatornák mobilitása csökken a sejtmembrán depolarizációjának hatására T limfóma sejtvonalakon. Feltételezésünk, hogy a sejtmembrán vastagsága megnőhet depolarizáció hatására. Ezen hipotézis igazolásához új módszerek kidolgozására volt szükség. A membrán két oldalát donor-akceptor párt alkotó festékkel jelölve a membrán vastagságának megváltozását egy távolságmérésre alkalmas módszer, fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) segítségével kívántuk megmérni. A sejtmembrán belső oldalát egy zöld fluoreszcens festékkel konjugált foszfolipiddel, TopFluor foszfatidil-szerinnel (PS) jelöltük meg. Normál körülmények közt ez a foszfolipid csak elhanyagolható mennyiségben van jelen a külső membránfélben, mivel a flippáz enzim ezeket a lipideket beforgatja. A kloroformban oldott festékből liposzómákat hoztunk létre, melyekkel 37 °C-on inkubáltuk a sejteket. Az optimális festés eléréséhez a hozzáadott festékkoncentrációk illetve inkubálási idők közül többet is kipróbáltunk. A membrán külső oldalát egy vörös fluoreszcenciájú lipidanalóggal, DiIC18-cal jelöltük meg. Alternatív módon a sejteket a szintén vörös emissziójú mCherry-GPI fúziós proteinnel transzfektáltuk, ami a membrán külső oldalán, lipid tutajokban dúsul fel. Mindkét donor-akceptor festékpár (PS-TopFluor + DiI, PS-TopFluor + mCherry-GPI) közt FRET-et mértünk konfokális mikroszkóppal. Sajnos a jelölések során kevés használható, kettős pozitív sejtünk volt. Jelenleg kipróbálunk egy olyan GFP-vel jelölt fehérje fragmentumot (PM-GFP), mely mirisztoilálódva a membrán belső oldalába épül be. A PM-GFP-t az mCherry-GPI fehérjével összekapcsolt fúziós fehérjeként fejezzük ki, melynek speciális linker szekvenciája a transzláció során kettétörik. A rendszer előnye, hogy a közös kifejeződés miatt a membrán belső és külső oldalán lokalizálódó termékek várható aránya 1:1. További FRET méréseinket ezen a rendszeren szeretnénk végezni.