Intracelluláris kalcium tartalom által vezérelt Ca2+-belépést szabályozó fehérjék vizsgálata C2C12 vázizom sejteken

Az intracelluláris kalciumraktár Ca2+-tartalma által vezérelt Ca2+-belépés (Store operated Ca2+ entry, SOCE) gyakorlatilag minden sejttípusban jelen van, és a belső raktárak ürülését (izomban ez a szarkoplazmatikus retikulum, SR) kapcsolja össze a plazmamembránban elhelyezkedő Ca2+-érzékeny csatornák aktiválódásával. A SOCE mechanizmus két kulcsfontosságú résztvevője egyrészt a kalciumfogyást érzékelő molekula (STIM), másrészt egy csatorna (Orai), amelyen keresztül a raktár újratöltése céljából kalcium lép a sejt belsejébe az extracelluláris térből. Célkitűzésünk, hogy meghatározzuk a SOCE-ban résztvevő molekulák (STIM1 és Orai1) szerepét az SR-böl történő Ca2+-felszabadulás szabályozásában. Ehhez, egér eredetű C2C12 immortalizált vázizom sejteket alkalmaztunk, melyek sejtfelszíni receptor és ioncsatorna eloszlását és működését kívántuk feltárni. Ehhez módosítottuk a sejtek gén expresszióját és vizsgáltuk ennek morfológiai és funkcionális következményeit. Az eGFP-myc-Orai1, valamint mCherry-STIM1 plazmid DNS-eket liposzóma mediált transzfekció révén juttattuk a C2C12 sejtekbe.A myoblastok differenciálódásának 3., 4. és 5. napján felaratott kontroll és transzfektált sejtekből származó fehérjemintákon végzett Western Blot analízis során azt találtuk, hogy míg kontrollban csupán a STIM1S (Short, 90 kDa) izoforma van jelen, addig a transzfektált sejteken a tenyészet differenciálódási idejének előrehaladtával a STIM1L (Long, 115 kDa) izoforma is megjelenik. A STIM1 diffúz, cytosolikus lokalizációt mutatott, majd a tenyésztés 5. napján a STIM1L lokalizáltan (ú.n. punktákban) jelent meg. Az Orai1 a STIM1-gyel azonos kifejeződési mintázatott mutatott, jelentős sejtfelszíni membrán lokalizációval. A SOCE funkcionális jelentőségének felderítésére C2C12 sejtekben, a belső raktárak ürítését Ca 2+-mentes Tyrode oldatban 4 µM tapszigarginnal konfokális mikroszkóp tárgyasztalán végeztük és azt találtuk, hogy az Orai1 követi a STIM1 punktákba rendeződését.A SOCE folyamatainak megértése fényt deríthet az [Ca2+]SR stabilitására hosszantartó izommunka esetén, és ezáltal, potenciálisan biztonságos terápiák kifejlesztésére ad lehetőséget öregedés és izomsorvadásos betegségekben.