Hiszton poszt-transzlációs módosítások és magasabbrendű kromatinstruktúrák közötti korrelációk keresése Saccharomyces cerevisiae sejtekben

A kromatin szerkezeti és funkcionális alapegysége a nukleoszóma, amely négyféle hiszton fehérjéből álló oktamerből és a rátekeredő, kb. 147 bázispárnyi DNS-ből épül fel. A nukleoszómák két fő része a középső globuláris domén és a szabályos térszerkezetbe nem rendeződő N- és C-terminális farki részek. Utóbbi szakaszok poszt-transzlációs módosításokon keresztül számos biokémiai folyamatot serkenthetnek vagy gátolhatnak (pl. transzkripció), másrészt töltésváltozáson és egyéb fizikai hatásokon keresztül közvetlenül is befolyásolhatják a kromatin szerkezetét. Munkám során poszt-transzlációsan modifikálható aminosav oldalláncokban mutáns hiszton fehérjék szerkezeti hatásait vizsgáltam – a kromoszómák több centiméteres dimenziójától kiindulva a nukleoszómák nanométeres szintjéig.

A kromoszómák/kromatin hurkok szerveződésében szerepet játszó egyszál folytonossághiányok (nick-ek) és a különféle epigenetikai tényezők kapcsolatát egy S1 nukleáz emésztéssel kombinált pulzáltatott erőterű gélelektroforetikus eljárással vizsgáltuk. Számos hiszton pontmutáns törzs kariotípusának és hurok-méretű fragmentációs mintázatának a meghatározása után megállapítottuk, hogy a mutációk következtében kieső hiszton modifikációk önmagukban nem okoznak szignifikáns változást a kromozómák és a kromatin hurkok szintjén.

A pont mutációkat hordozó hiszton fehérjék nukleoszómális szerveződésre gyakorolt szerkezeti hatását egy ún. single-pair FRET nevű biofizikai módszerrel vizsgáltuk az egyedi sejtek szintjén (kollaboráció Prof. Jörg Langowski csoportjával – Biophysics of Macromolecules, DKFZ, Heidelberg). Vad típusú és poszt-transzlációsan módosítható aminosav oldalláncokban mutáns hiszton fehérjékből in vitro nukleoszóma rekonstitúciót végeztünk oly módon, hogy a nukleoszómára tekert DNS fluoreszcens jelet hordoz (FRET donor/akceptor pár). Pozitív kontrollként elvégzett sikeres spFRET mérések után jelenleg a mutagenizált hisztonok rekonstitúcióján dolgozunk. Több sikeres rekonstitúció után jó esély van arra, hogy a fenti kísérletek feltárják a hiszton modifikációk, illetve a mutációk következtében kieső PTM-ek nukleoszóma és kromatin szerkezetben okozott változások strukturális hátterét.