A SNAP25 fehérje szabályozása foszforilációval

A neurotranszmitterek felszabadulásának szabályozásában kiemelt fontosságú a szinaptikus fehérjék foszforiláció általi szabályozása. A fehérjék foszforilációs szintjét a protein kináz és foszfatáz enzimek határozzák meg, azonban a neuronális jelátviteli folyamatokban részt vevő enzimek és szabályozási mechanizmusuk még nem minden részletében ismert. Az egyik szabályozó elem a szinaptikus vezikulák kibocsátásában szerepet játszó SNARE komplex, amely szintaxin, szinaptobrevin és SNAP25 fehérjék komplexeként a szinaptikus membrán és a vezikula kapcsolatát hozza létre. A SNAP25 fehérjét a PKC és PKA (protein kináz A és C) is foszforilálja a Ser187 oldalláncon, azonban ismereteink hiányosak a SNAP25 és szintaxin defoszforilációjáért felelős protein foszfatáz enzimekről. Munkacsoportunk előzetes kísérletei alapján a preszinapszisban a Ser/The protein foszfatáz-1 enzimcsalád tagjai közül csupán a MYPT1 szabályozó alegységből és PP1c katalitikus alegységből álló miozin foszfatáz holoenzim (PP1M) van jelen, ezért célkitűzésünk a SNARE komplex PP1M általi szabályozásának vizsgálata volt. A PP1M jelenlétét kimutattuk B50 sejtekben Western blot analízissel és immunfluoreszcenciás vizsgálatokkal. MYPT asszociációját ROK-kal, a PP1c izoformáival, és a neurotranszmitter kibocsátásban kulcsszerepet játszó SNARE komplex elemeivel (SNAP25, szintaxin) is leírtuk. B50 neuroblastoma sejtvonalban sikeresen csendesítettük a PP1M holoenzim szabályozó (MYPT1), illetve katalitikus (PP1) alegységeit. A csendesítés során a PP1M mindkét alegységének expressziója 70-80%-ban gátlódott. A PP1M csendesített sejtek protein foszfatáz enzimaktivitása 30%-os csökkenést mutatott. Ezzel párhuzamosan a PP1M-csendesített neuroblasztóma sejtekben sikerült kimutatnunk a SNAP25 Ser187 és szintaxin Ser14 aminosav oldalláncok emelkedett szintű foszforilációját foszfospecifikus antitestekkel. Eredményeink arra utalnak, hogy a SNAP25 és szintaxin feltételezhetően a PP1M enzim neuronális szubsztrátjai, aminek defoszforilációja által az idegsejtek neurotranszmitter kibocsátását szabályozza a SNARE komplex kialakulásának aktiválása által.