Vizsgálatok célja: Ismeretes, hogy az opportunista humán patogén Candida albicans-ban található protein foszfatáz Z1 (CaPpz1) enzim szerepet játszik a gomba ozmotikus stabilitásában, sejtfal integritásában és oxidatív stressztűrésében. Célom az, hogy megvizsgáljam a Saccharomyces cerevisiae-ben már leírt Hal3 és Cab3 fehérjék feltételezett C. albicans ortológjainak (CaHal3 és CaCab3) szerepét a CaPpz1 foszfatáz regulációjában.
Módszerek: A CaHAL3 és a CaCAB3 gének intronmentes kódoló régióit a pGEX-6p-1 expressziós vektorba ligálva Escherichia coli BL21 DE3 RIL sejtekbe transzformáltam. A glutation-S-transzferázzal fuzionált CaHal3 és a CaCab3 fehérjéket isopropil-β-D-tiogalaktoziddal indukáltam. A rekombináns fehérjéket Glutation Sepharose 4-B gyantán affinitás kromatográfiával tisztítottam. A CaPPZ1 cDNS-ét pET28a(+) vektorba klónozva E. coli BL21 DE3 RIL sejtekbe transzformáltam, majd a CaPpz1 fehérjét 6xHis-címkével együtt expresszáltattam és Ni-NTA Agaróz gyantán affinitás kromatográfiával tisztítottam. A CaPpz1 enzim foszfatáz aktivitását p-nitrofenil-foszfát szubsztráttal mértem. Negatív kontrollként az üres pET28a(+) illetve pGEX-6p-1 vektorokkal transzformált baktériumokból tisztított fehérje elegyet használtam.
Eredmények: A rekombináns CaPpz1, CaHal3 valamint a CaCab3 fehérjék bakteriális expresszióját és affinitás kromatográfiával történő tisztítását követően az in vitro foszfatáz aktivitásmérések eredményeiből megállapítottam, hogy a CaPpz1 enzim aktivitása csökkent, hozzáadott CaHal3 fehérje koncentrációjától függő módon. A foszfatáz aktivitása nem változott a hozzáadott CaCab3 fehérje hatására.
Következtetés: Az in vitro aktivitás mérések alapján elmondható, hogy a CaHal3 fehérje szabályozhatja a CaPpz1 enzim foszfatáz aktivitását, míg a szerkezetileg hasonló CaCab3 fehérje nem rendelkezik ilyen hatással.