Anti-AMPK shRNS vektor konstrukt létrehozása

Munkám során olyan vektor konstruktot hoztam létre, mely AMPKα1 specifikus, géncsendesítésre alkalmas oligonukleotidokat tartalmaz. Ehhez a pSuper plazmidot használtuk, mely egy olyan emlős expressziós vektor, amely az siRNS molekulák intracelluláris szintézisét teszi lehetővé. A kész konstrukt ezután tranziens és stabil transzfekcióhoz egyaránt használható, hatékonyan és specifikusan csökkenti az adott gén expresszióját az RNS interferencia jelenségét kihasználva. Az oligok tervezését a Serial Cloner szoftver segítségével végeztük, a génspecifikus szekvenciákat nyilvános adatbázisokból (Sigma) kerestük ki. A szensz DNS oligonukleotid 5’-3’ irányban a következő elemeket tartalmazza: BglII ragadós vég; génspecifikus szakasz; hurok szakasz; génspecifikus szakasz reverz komplementere; polyT farok. Az antiszenz oligonukleotid szekvenciája ennek pontosan a reverz komplementere úgy hogy az 5’ végen HindIII ragadós véget tartalmaz a 3’ végen pedig hiányzik a BglII szakasz. A ligáláshoz használt inszert ennek a két, egyenként 64 bázisból álló oligonukleotidnak az egymáshoz hibridizálásából jött létre. A ligáláshoz az így létrejött kettős szálú DNS két végén lévő HindIII illetve BglII ragadós végeket használtuk fel. A cirkuláris plazmidot ugyanezen enzimek segítségével külön-külön emésztettük majd T7-ligáz segítségével ligáltuk. A kész plazmiddal kompetens DH5α sejteket transzformáltunk, majd szelektív táptalajon növesztettük őket. A pozitív klónokat EcoRI és HindIII kettős emésztéssel szűrtük. A kész konstruktot AMPKα1 gén csendesítéséhez fogjuk felhasználni MCF-7 emlőrák sejtekben, melyben a kutatócsoportunk által korábban AMPK aktiválószerrel előidézett anti-Warburg hatás hátterét kívánjuk feltérképezni.