Rec-flow: rekombinációs ráta mérése áramlási citometriával

Bevezetés: Munkánk során különféle mutációk rekombinációs rátára gyakorolt hatását mértük egy speciális áramlási citometria alapú módszerrel, vad típusú és mutáns Saccharomyces cerevisiae törzsekben.
Anyagok és módszerek: Mérésünk alapja egy olyan centromérikus plazmid transzformációja volt, amely egy galaktóz-indukálható promóter (pGAL1) által meghajtott funkcióképtelen (tehát nem fluoreszkáló) GFP gént kódolt. Az GFP gén megszakításához használt LacZa inzerció kivágódása ún. transzkripció-függő rekombináció hatására történhet meg, amely a GFP kódoló régiójának helyreállításán keresztül zölden fluoreszkáló sejtek megjelenéséhez vezet. Kísérleti rendszerünkben két módszerrel indukáltuk a transzkripciót és ezáltal detektálhatóvá tettük a rekombinációt: i. galaktóz metabolizmussal, ii. egy ösztogén indukálható virális fúziós enhanszer fehérjét (GAL4-ER-VP16) expresszáló plazmid kotranszfekciójával, amely ösztradiol hatására kapcsolja be a pGAL1 promótert.
Eredmények: Vad típusú, tho1 deléciós és hiszton H3 pontmutáns törzsekben FACSscan áramlási citométerrel mértük a zölden fluoreszkáló sejtek mennyiségét és százalékos eloszlását, amelyből rekombinációs gyakoriságot számoltunk represszív és induktív körülmények között. Kimutattuk, hogy a THO1 gén mutációja (amelyről ismert, hogy befolyásolja az mRNS splicing-ot) szignifikánsan növeli a rekombinációs rátát.
Következtetés: Módszerünk megbízhatóan használható mutációk rekombinációra gyakorolt hatásának kvantifikálására. Célunk a mérés felskálázása 96- vagy 384-lyukú plate formátumra egy citometria-alapú rekombinációs screen beállításához.