Biotinált Spi-B és Sfpi1 fehérjéket kódoló plazmidok létrehozása és azok kifejezése embrionális őssejtekben

A dendritikus sejtek (DS-ek) professzionális antigén prezentáló sejtek, melyek fontos szereppel bírnak az adaptív immunválasz kialakulásában. Kutatócsoportunk célja az embrionális őssejt (ES) eredetű DS-ek létrehozásának optimalizálása transzkripciós faktorok segítségével. Előzetes eredmények alapján az Spi-B és az Sfpi1 (PU.1) transzkripciós faktorok pozitívan befolyásolják az ES eredetű DS kialakulást, ezért szeretnénk jobban megismerni ezeknek a fehérjéknek a szerepét. Munkánk célja olyan génexpressziós rendszerek kialakítása volt, melyek ezen gének biotinált változatait kódolják, és olyan egér embrionális őssejt vonalak létrehozása, melyekben a biotint hordozó fehérjék termelése doxiciklinnel indukálható (Tet-regulált génexpresszió).
Először a két gén fehérje-kódoló régióját PCR segítségével reamplifikáltuk és ezzel párhuzamosan egy in vivo biotinálható peptid szekvenciát építettünk be Gateway-kompatibilis primerek segítségével. A targetáló vektorok létrehozása Gateway technológiával történt. A klónozás két, mutációk nélküli biotinált fehérjéket kódoló plazmidot eredményezett. A targetáló vektorokat genetikailag módosított egér ES sejtvonalba transzfektáltuk, melyek egy speciális rekombináció segítségével (indukálható kazetta csere) integrálódtak a genomba.
Neomycin szelekció hét Bio-Sfp1 indukálható gént tartalmazó klónt és egy Bio-Spi-B gént expresszáló klónt eredményezett. Az őssejt klónok felnövesztése után két különböző koncentrációjú doxiciklin kezeléssel ellenőriztük a transzgének indukálhatóságát. Kvantitatív PCR elemzések eredményei igazolták, hogy a transzgének magas, indukció függő kifejeződést mutatnak minden klónban, igazolva a transzfekció sikerességét és a transzgének megfelelő integrálódását.
Összegezve sikerült biotinnal jelölt transzkripciós faktorokat kifejező egér embrionális őssejt vonalakat létrehozni, melyek fehérje-fehérje és fehérje-DNS kölcsönhatások felderítésére is alkalmasak lehetnek.