A protein foszfatáz 2A és a flotillin-1 fehérje kölcsönhatásának vizsgálata

A szerin-treonin (Ser/Thr) specifikus foszfatázok csoportjába tartozó protein foszfatáz 2A (PP2A), szerkezeti felépítését tekintve három alegységből áll. Az A szerkezeti és a C katalitikus alegység dimerjéhez, egy harmadik úgynevezett B regulátor alegység (PP2A B) kapcsolódik. A különféle B alegységek a holoenzimek szubsztrátspecificitását és a sejten belüli lokalizációját határozzák meg. Munkacsoportunk korábban tüdő artéria endotél sejtekből végzett pull down kísérletből származó minta tömegspektrometriás analízisével, a flotillin-1 fehérjét, mint a rekombináns GST-PP2A Bα fehérje új kölcsönható partnereként azonosította. A flotillin fehérjék a sejtfelszíni receptorok és a citoszkeleton közötti kapcsolat létrehozásában, jelátviteli folyamatokban részt vevő membránfehérjék.
Jelenlegi munkánk célja volt, a PP2A holoenzim és flotillin-1 fehérje kölcsönhatásának további vizsgálata, melyhez az alábbi kísérleteket terveztük elvégezni. Tüdő artéria endotél sejtekből készített cDNS felhasználásával a flotillin-1 szekvenciájának felsokszorosítása szubklónozásra alkalmas primerekkel, majd a pGEX-4T-2-flotillin-1 rekombináns plazmid létrehozása. A rekombináns GST-flotillin-1 termeltetésének optimalizálása eltérő IPTG koncentráció és hőmérséklet alkalmazásával. A tisztított GST-flotillin-1 és PP2A holoenzim közti kölcsönhatás vizsgálata pull down kísérletben endotél sejtek felhasználásával. A PP2A Bα és flotillin-1 kölcsönhatás sejten belüli lokalizációjának vizsgálatához immunfluoreszcens kísérletek elvégzése, valamint a kölcsönhatás fiziológiai jelentőségének tisztázása.
Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy sikeresen előállítottuk a pGEX-4T-2-flotillin-1 rekombináns plazmidot, optimalizáltuk a GST-flotillin-1 fehérje termeltetését. A tisztított GST-flotillin-1 fehérje képes volt a PP2A holoenzim A, C és Bα alegységét pull down kísérletben megkötni. Az endogén fehérjék közötti kölcsönhatást immunprecipitációs és immunfluoreszcens kísérletekkel igazoltuk. A továbbiakban szeretnénk a PP2A Bα és flotillin-1 fehérjéket specifikus siRNS-ek felhasználásával depletálni az endotél sejtekben és a csendesítés hatását megvizsgálni.