Nfil3 transzkripciós faktort termelő egér embrionális őssejtek létrehozása és jellemzése

A dendritikus sejtek az adaptív immunválaszban résztvevő professzionális antigén prezentáló sejtek, melyeknek kitüntetett szerepük van az immunválasz elindításában. Kutatásunk célja az embrionális őssejt eredetű dendritikus sejtek létrehozásának optimalizálása transzkripciós faktorok segítségével. Célunk olyan transzkripciós faktorok aktiválása melyek fontos szerepet játszanak a dendritikus sejtek fejlődésében. Az egyik ilyen faktor az Nfil3 fehérje, melynek hiányában a CD8α+ dendritikus sejtek fejlődése negatívan szabályozott.
Vizsgálataink során, rekombináción alapuló Gateway technológia felhasználásával egér Nfil3 gént tartalmazó targetáló vektort hoztunk létre. A gén kódoló régióját PCR segítségével felamplifikáltuk, majd Gateway-specifikus rekombinációval (BP-reakció) a pDONR-vektorba integráltuk. Ezt követően a beépült DNS fragmentet átvittük a P2lox célvektorba a második Gateway-specifikus rekombinációval (LR-reakció). Az így létrejött targetáló plazmid Nfil3 kódoló szakaszát megszekvenáltuk; eredményeink szerint a plazmid nem tartalmazott mutációt.
Ezt követően a vektort a doxiciklinnel szabályozható ZX.1 nevű egér embrionális őssejtekbe transzfektáltuk elektroporáció segítségével. A transzfektálást követően a geneticin rezisztens őssejteket kiszelektáltuk. Vizsgálataink révén három sejtklónt sikerült elkülöníteni és tovább tenyészteni. Az embrionális őssejt klónokat, két különböző koncentrációjú doxiciklinnel kezeltük meg, hogy leellenőrizzük a transzgén indukálását. Kvantitatív RT-PCR –en végzett méréseink igazolták, hogy mindhárom klónnál az Nfil3 gén indukálódott doxiciklin kezelés hatásra. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a transzgén megfelelően beintegrálódott az őssejtekbe és szabályozott módon képes kifejeződni.
Összegzéskép fontos kiemelni, hogy sikerült egér embrionális őssejt vonalat létrehozni, amely ki tudta fejezni az Nfil3 transzkripciós faktort. A jövőben célunk az Nfil3 transzkripciós faktort expresszáló embrionális őssejt eredetű dendritikus sejtek differenciálódásának vizsgálata.