Az ABCG2 konformáció változásainak vizsgálata fluoreszcenciás módszerekkel

A humán ABCG2 az ABC-kazettás transzporterek családjába tartozó aktív pumpa. Endogén szubsztrátjai (pl. húgysav, porfirinek) mellett, számos gyógyszert és xenobiotikumot is képes kipumpálni a sejtekből, így szerepet játszik ezek abszorpciójában és eliminációjában. A tumor sejteken is gyakran kifejeződik és mivel számos daganat ellenes szer is szubsztrátja a tumorok kemoterápia rezisztenciájának az ún. multidrog rezisztenciának a kialakításában is részt vesz. Számos ABC transzporter kristályszerkezete alapján feltételezhetjük, hogy az ABCG2 két konformációs állapot, egy nukleotid mentes, intracelluláris oldalról nyitott és egy nukleotid kötött, intracelluláris oldalról zárt állapot között fluktuál. Az azonban kevéssé ismert, hogy az ATP kötését és hidrolízisét milyen konformáció változások kísérik és ezek milyen kapcsolatban vannak a szubsztrátok megkötésével és transzportjával. Ezért munkánk fő célja, hogy kidolgozzunk egy olyan módszert, amely lehetővé teszi az ABCG2 fehérje konformáció változásainak követését katalitikus ciklusának különböző lépései során.
Méréseink során ABCG2-vel stabilan transzfektált MDCK sejteket használtunk, melyeket streptolizin-O toxinnal permeabilizáltunk, így lehetőségünk volt a sejtekből kimosni a nukleotidokat, majd különböző hidrolizálódó és nem hidrolizáló nukleotidokkal helyettesíteni. A komplex epitóppal rendelkező, konformáció érzékeny kötődésű 5D3 antitestettel vizsgáltuk az ABCG2 konformáció változásait a nukleotid kötés modulálása során.
Kimutattuk, hogy ATP hiányában az ABCG2 molekulák 5D3-kötő konformációba kerülnek, míg ATP/Mg2+ vagy ADP adásának hatására a fehérjék nukleotid koncentráció-függő hányada tartózkodik az antitest számára nem felismerhető konformációban. A nátrium-ortovanadát az ATP hidrolízisét követően a foszfát helyére kötődve csapdázza a transzporter molekulákat a hidrolízist követő állapotban, melyhez vizsgálataink szerint nem kötődik az 5D3 antitest. Eredményeink alapján elmondható, hogy kidolgoztunk egy olyan módszert, mellyel jól detektálhatóak az ABCG2 nukleotid kötés és hidrolízis függő konformáció változásai.