Magreceptorok dimerizációjának és mobilitásának vizsgálata áramlási citométerrel

A magreceptorok szupercsaládjába olyan fehérjék tartoznak, amelyek ligandfüggő módon képesek szabályozni célgénjeik átírását. Kutatásunk során a retinoid receptorok családjába tartozó reténsav receptor (RAR), a peroxiszóma-proliferátor aktiválta receptor (PPARg) és a retinoid X receptor (RXR) kölcsönhatásait vizsgáljuk élő sejtekben. Működésüket a molekuláris kapcsoló modell írja le. Ezek a receptorok ligand hiányában DNS-hez kapcsolódva korepresszor komplexet kötnek és gátolják célgénjeik átíródását. A modell szerint agonista ligand hatására (az A vitamin származékai) a receptorok konformációváltozáson mennek keresztül, melynek során koregulátor csere történik és a korepresszor komplex aktivátor komplexre cserélődik. Ezt a modellt a területen zajló intenzív kutatások eredményeképp egyre dinamikusabb kép kezdi felváltani.
Vizsgálataink során arra voltunk kíváncsiak, hogy hogyan változik a receptorok egymáshoz való affinitása egy olyan rendszerben, mindhárom fehérje (RAR, PPAR, RXR) jelen van.
Az egymáshoz való kötődés vizsgálatához AD-293T sejteket transzfektáltunk kék, zöld, és vörös fluoreszcens fehérjékkel jelölt RAR, RXR és PPARg magreceptorokkal. Az affinitásban bekövetkező változásokat FACS Aria áramlási citométeren fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FACS-FRET) segítségével kívántuk meghatározni. Ez a módszer alkalmas arra, hogy az fentebb említett tulajdonságok változását élő sejtekben kövessük nyomon, ezáltal lehetőségünk van vizsgálni a ligandkezelés hatásait is.
A FRET hatásfok igen érzékeny a fluorofór pozíciójára, ezért N és C végen jelölt magreceptorok között is vizsgáltuk a FRET hatásfokot és ezzel együtt a dimerizáció mértékét. Ez a kísérleti elrendezés alkalmas a heterodimerizáció és az RXR homodimerizáció vizsgálatára is. Eredményeink azt mutatták, hogy agonista ligand hatására erősödik a heterodimerizáció a két receptor között. RXR agonista liganddal történő kezelése után a homodimerizáció mértéke is növekedett.
Korábban végzett FCS vizsgálataink a jelenlegi FACS-FRET mérésekkel együtt egy igen komplex rendszer képét kezdik kirajzolni és megerősítik az RXR központi szerepét a magreceptorok aktivációjában.