Ekdizon receptor ligandkötésének vizsgálata emlős kettős-hibrid rendszerrel

A magreceptorok olyan transzkripciós faktorok, amelyek ligand függő módon képesek szabályozni célgénjeik kifejeződését. A magreceptorok doménszerkezetére jellemző az N-terminálisan elhelyezkedő DNS-kötő domén, C-terminális ligand kötő domén és az ezeket összekötő híd régió.
Ligandjaik kisméretű lipidoldékony molekulák, például hormonok, anyagcseretermékek. A magreceptorok által szabályozott célgének ligand menetes miliőben represszált állapotban vannak. Ilyenkor a receptor korepresszor komplexet köt. Ligand kötés hatására korepresszor koaktivátor csere történik és elindulhat a célgén kifejeződése.
Az ekdizon receptor (EcR) ízeltlábúakban megtalálható magreceptor. Először Drosophila melanogaster-ből izolálták. Természetes agonistái az ekdiszteroidok (20-hidroxiekdizon), amelyek hatására a jól ismert molekuláris kapcsoló mechanizmuson keresztül képesek célgénjeik transzkripcióját elindítani. DNS-kötött formában az USP (Ultraspiracle)-el képes heterodimerizálódni, amely fehérje az emlősökben megtalálható RXR (Retinoid-X-Receptor) ortológja. A ligandot kötött receptor kulcsszerepet tölt be az állatok vedlésének és egyedfejlődésének szabályozásában.
A kísérleteket az iGEM (International Genetically Engineered Machine) szintetikus biológia versenyre való felkészülés alatt végeztük. Célunk egy olyan magreceptor készlet készítése volt, amely a Biobrick alapítvány tárházát bővíti. Emlős kettős-hibrid rendszert alkalmazva vizsgáltuk az ekdizon receptor aktivációs képességét egy tipikus ekdiszteroid (Ponasterone A) hatására. A kísérletek első fázisában egy átmeneti vektorban fúzionáltattuk az ekdizon receptor ligand kötő doménjét az élesztő eredetű Gal4 DNS-kötő doménnel. A fúzionáltatott fehérjét kódoló gént ezután expressziós vektorba klónoztuk. A transzfekciót COS-1 sejtvonalon végeztük PEI (polietilénimin) alkalmazásával. A transzfekciót követően ligandkezelést végeztünk a transzfektált sejteken majd, egy napig inkubáltuk és lemértük a riporter konstruktok által kódolt enzimek aktivitását.