Eukarióta expressziós vektorok standard elemekből történő összeállítása és vizsgálata (az iGEM RFC-25 szabványának megfeleve)

Az "International Genetically Engineered Machine competition" (iGEM) a "Synthetic Biology Based on Inter-changeble Parts" mozgalom terjesztésének módszere, melynek célja a szintetikus biológia egyszerűsítése a szabványosítás és a mérnöki tervezés eszközeinek felhasználásával. A cél kis DNS elemekből (Standard BioBrick parts) működő összetett egységek összeállítása különböző szabványoknak megfelelve. A magreceptorok zsíroldékony molekulák bio-szenzorai, melyek az iGEM eszköztárából ezidáig hiányoztak. Célunk volt az általunk összeszerelt lipid szenzorok kifejeződésének biztosítása különböző sejtekben az általunk standard alapelemekből felépített expressziós vektorban. A klónozás során a pSB1A3 ampicillin rezisztenciát kódoló hordozó vektort (BackBone) minden egyes alkalommal, az RFC-25 standardnak megfelelően AgeI és PstI restrikciós enzimekkel megnyitottuk és a TRE-CMV (Tetraciklin válaszadó elem-minimál Citomegalovírus promóter), Gal4 DBD (arteficiális DNS kötő domén)-PXR (Pregnán X Receptor) LBD (Ligandkötő domén) vagy a Gal4 DBD-Ecr (Ecdysone Receptor) LBD és a PolyA inzerteket beligáltuk. Az inzerteket kloramfenikol rezisztenciát hordozó plazmidokból hasítottuk ki NgoMIV és PstI restrikciós enzimeket alkalmazva. A klónozás sikerességét restrikciós emésztéssel, az inzert méretek alapján illetve szekvenálással ellenőriztük. A génkifejeződést fehérje szinten Western-blottal vizsgáltuk, anti-Gal4 primer antitestet alkalmazva. Az összetett lipid szenzor konstruktokat aktivációs és két-hibrid rendszerben teszteltük a ligand általi aktivációjuk és RXR (Retinoid X Receptor)-rel való heterodimerizációs képességük vizsgálatára. Mind a restrikciós analízis, mind a szekvenálás bizonyította pSB1A3-TRE-CMV-Gal4 DBD-PXR LBD-PolyA és a pSB1A3-TRE-CMV-Gal4 DBD-EcR LBD-PolyA expressziós vektorok kialakításának sikerességét, ezenfelül működőképességüket a nagyjából 40 kDa tömegű fúziós fehérje diszkrét sávja jelezte. A fúziós fehérjék nem aktiválódtak az ismert ligandokra ugyanakkor vizualizálható volt a korábban leírt PXR-RXR heterodimerizáció. Az expressziós vektor tetraciklin általi szabályozhatóságát a jövőben kívánjuk vizsgálni.