A belső Ca2+-raktár által vezérelt Ca2+-belépés vizsgálata TRPC1 fehérjét overexpresszáló C2C12 myotubulusokban

Printer-friendly versionPrinter-friendly version
Conference: 
2009/2010. tanévi helyi TDK konferencia
Szekció: 
Élettan, Kórélettan
Szerző(k):
Lamos Melinda
Intézet:
Élettani Intézet
Témavezető(k):
Dr. Szentesi Péter

Az endoplazmás retikulum (ER) Ca2+-tartalmának kiürülése során a belső raktárak feltöltésére az extracelluláris térből Ca2+-beáramlás történik. Ezen jól szabályozott Ca2+-felvételi mechanizmust raktár által vezérelt Ca2+-belépésnek nevezzük (SOCE), melynek működése számos fehérje (STIM1, Orai1 és TRPC1) együttműködésétől függ. Korábbi adakból ismert, hogy a STIM1 feladata a [Ca2+] érzékelése az ER-ben, az Orai1 a felszíni membrán Ca2+-csatornája, míg a TRPC1 (Transient Receptor Potential Canonical) szerepe ezidáig tisztázatlan.
Kísérleteinkben liposzóma mediált plazmid transzfekcióval C2C12 egér eredetű vázizomsejtekben túltermeltettük a TRPC1 fehérjét. Az overexpressziót mRNS szinten RT-PCR-ral, fehérje szinten pedig immuncitokémiával és Western-blot technikával igazoltuk. A transzfektált sejteken a SOCE által az [Ca2+]i-ban bekövetkező változásokat mértük, amit az ER Ca2+-pumpáját (SERCA) gátló thapsigargin hozzáadásával értünk el. A TRPC1 overexpresszió eredményeként a SOCE amplitudója (117,0+/-11,1 nM, n=18 a kontroll és 242,5+/-39,6 nM, n=10 a TRPC1 overexpresszáló C2C12 myotubulusokban) és felszállási meredeksége szignifikánsan nőtt (3,5+/-0,7 nM/s, a kontroll és 6,7+/-1,5 nM/s, a TRPC1 overexpresszáló C2C12 myotubulusokban). A TRPC antagonista, YM-58483 alkalmazása során a TRPC1-t overexpresszáló myotubulusokban a SOCE meredeksége szignifikánsan, amplitúdója pedig kissé, de nem szignifikánsan csökkent, ami a STIM1-Orai1 rendszer csökkent működésére utal. Ezekben a sejtekben a STIM1 valamint a SERCA expressziójának csökkenését Western-blot technikával igazoltuk is. Utóbbi magyarázhatja azon megfigyelésünket, hogy 120 mM KCl által kiváltott Ca2+-tranzienseket követően a Ca2+-visszavétel lassult, és magasabb nyugalmi [Ca2+]i volt megfigyelhető. A TRPC1 fehérje túltermeltetése hatására morfológiai változásokat is észleltünk, a myoblastok differenciálódása később kezdődött, és a myotubulusok vékonyabbak voltak a kontroll sejtkultúrákhoz viszonyítva.
Eredményeink arra utalnak, hogy a TRPC1 expressziójának növelése a SOCE emelkedését okozza, és negatív visszacsatolással szabályozza a STIM1-Orai1 rendszert, valószínűvé téve ezen fehérjék együttműködését.

Támogatók: Támogatók: Az NTP-TDK-14-0007 számú, A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése helyi konferencia keretében, az NTP-TDK-14-0006 számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása, NTP-HHTDK-15-0011-es A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése 2016. évi helyi konferencia keretében, valamint a NTP-HHTDK-15-0057-es számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása című pályázatokhoz kapcsolódóan az Emberi Erőforrás Támogatáskezelő, az Emberi Erőforrások Minisztériuma, az Oktatáskutató és Fejlesztő Intézet és a Nemzeti Tehetség Program