Áramlás-módosított vonWillebrand faktor kötőhelyeire specifikus peptidek keresése

Printer-friendly versionPrinter-friendly version
Conference: 
2009/2010. tanévi helyi TDK konferencia
Szekció: 
Molekuláris biológia, Fejlődésbiológia, Genetika, Bioinformatika, Genomika
Szerző(k):
Szakács Levente
Péter Margit
Intézet:
Klinikai Kutató Központ
Témavezető(k):
Dr. Hársfalvi Jolán

Az érett von Willebrand faktor (VWF) ismétlődő alegységekből álló multimer formájában (20-40 MDa) van jelen a plazmában. Érfal sérülés esetén az alegységek A1 és A3 doménjei -a kollagén és thrombocyta receptor GPIb kötőhelyeikkel- a szubendothélium és a thrombocyták kapcsolatát közvetítik. Normál körülmények közt a GPIb affinitása a VWF iránt alacsony. Magas nyíróerők (>800/s) vagy a VWF kitapadása esetén viszont képessé válnak kölcsönhatásba lépni egymással. Feltételezik, hogy a nyíróerő vagy az immobilizáció hatására a VWF konformációja megváltozik, melynek következtében a korábban fedett GPIb kötőhelyek szabaddá válnak. Munkám célja olyan peptidek keresése, melyek kollagénre magas nyíróerő alatt immobilizált VWF-on szabaddá vált helyekhez kötődnek. A magas nyíróerőt Impact-R (DiaMed, Svájc) síkon forgó kúp rendszerű készülék alkalmazásával értük el. A peptidek keresésére Phage Display technológiát alkalmaztam, mely fágszelekciós és amplifikációs eljárások sorozata. E. coli specifikus bakteriofág (M13) egy insert-DNS hatására a pIII felszíni proteinjéhez heptapeptidet szintetizál. Ph.D.-7 Phage Display Peptide Library Kit (New England, USA) fág könyvtárat használtam, amely a heptapeptid 2,8*109 számú lehetséges szekvencia-kombinációját kifejező fágokat tartalmaz. Ebből 2*1011 fágot inkubáltam a kollagénen immobilizált VWF-el. Nem specifikus elució után a VWF-hoz specifikusan kötődött fágokat E. coli kultúrához adva amplifikáltam. A szelekciós és az amplifikációs lépéseket háromszor végeztem el, az eluált fágok titerét minden szelekciós kör után meghatároztam (1.kör: 5.2*1012 fág/ml, 2.kör: 4.2*1012 fág/ml, 3.kör: 4.7*1012 fág/ml). A harmadik körben amplifikált fágok vegyes ssDNS szekvenciát mutattak, két kísérletsor esetén is. Az utolsó titerlemezről 94-94 egyedi kolóniát szaporítottam, és teszteltem a fágok VWF kötő képességét. Az egyedi fágklónok DNS szekvenálása eredményeként a szelektált fágok heptapeptidjeinek az aminosav szekvenciáiban YS azonosság található ’MACAW’ szoftvert szerint. Több egyedi klónból izolált ssDNS analízise, nagyobb számú aminosavból álló homológ szekvenciák keresése és azok protein bankkal való egyeztetése folyamatban van.

Támogatók: Támogatók: Az NTP-TDK-14-0007 számú, A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése helyi konferencia keretében, az NTP-TDK-14-0006 számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása, NTP-HHTDK-15-0011-es A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése 2016. évi helyi konferencia keretében, valamint a NTP-HHTDK-15-0057-es számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása című pályázatokhoz kapcsolódóan az Emberi Erőforrás Támogatáskezelő, az Emberi Erőforrások Minisztériuma, az Oktatáskutató és Fejlesztő Intézet és a Nemzeti Tehetség Program