Az adenozin 2A receptor és a katepszin D proteáz kölcsönhatásának funkcionális vizsgálata

Munkacsoportunk korábban azonosította az adenozin 2A receptor C-terminális domén (A2Ac) és a katepszin D (CtsD) fehérje kölcsönhatását egér peritoneális makrofágokban (IPMQ).
Az A2A az adenozin receptorok családjába tartozó G-fehérje kapcsolt transzmembrán receptor, amely rendelkezik egy 122 aminosavból álló, flexibilis intracelluláris doménnel. Ez a domén lehetővé teszi, hogy az A2A nem csak receptorként funkcionál, hanem fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakításában is részt vesz.
A CtsD egy aszpartil proteáz, amely sejtek lizoszómájában található, azonban a sejtalkotó membránjának sérülése következtében kiszabadulhat a sejtplazmába és kölcsönhatásba léphet más fehérjékkel. Korábban azonosították a szfingozin kináz 1, X-kapcsolt apoptózis-gátló fehérje (XIAP), B-sejtes limfóma-2 (Bcl-2) fehérjéket, mint a CtsD sejtplazmában található szubsztrátjait és igazolták az apoptózis indukálásában betöltött szerepét.
Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk az A2Ac szubsztrátja lehet-e a CtsD enzimnek. Ennek érdekében az A2Ac domént GST-fúziós fehérje formában fejeztettük ki E. coli BLR jelű baktérium törzsben. A rekombináns fehérjét Magne-GST eljárással tisztítottuk a baktérium sejtek felülúszó frakciójából és felhasználtuk CtsD enzimaktivitás vizsgálatokhoz. A CtsD enzimet specifikus antitest alkalmazásával egér IPMQ sejtekből izoláltuk immunprecipitációval. Az immunkomplex aszpartil proteáz aktivitását fluoreszcensen jelölt oligopeptid szubsztrát alkalmazásával mutattuk ki, az enzim specifikusságát pedig aszpartil proteáz inhibitor (pepstatin A) gátlással igazoltuk. Ezt követően a rekombináns GST-A2Ac-t az aktív CtsD enzim jelenlétében inkubáltuk és SDS-PAGE módszerrel ellenőriztük, hogy proteolitikus hasítás következtében lebomlik-e az A2Ac fehérje.
Vizsgálatunk eredményeként, azt tapasztaltuk, hogy a makrofágokból izolált CtsD enzim nem hasította az A2Ac doménjét, tehát nem szubsztrátja a makrofág sejtekből izolált proteáznak.
Továbbiakban az A2A receptor és a CtsD lokalizációját kívánjuk ellenőrizni a makrofágokban. Ennek érdekében mCherry fehérjével fúzionálva kívánjuk kifejezni és nyomon követni a receptort.