Az afsR szerepének vizsgálata a Streptomyces griseus antibiotikum termelésének és differenciálódásának szabályozásában

.Az antbiotikumok széleskörű egészségügyi felhasználásával párhuzamosan elkezdődött a rezisztens kórokozók kiszelektálódása és gyors terjedése, mely egy „poszt-antibiotikumos” kor eljövetelével fenyeget és új típusú antibiotikumok felfedezését sürgeti. A Streptomyces baktériumok széleskörű szekunder metabolit termelő képességük miatt kerültek az antibiotikum kutatás középpontjába. Antibiotikum termelésük elindításában kulcsfontosságúak az extracelluláris autoregulátor molekulák, mint pl. a S. griseus által termelt A-faktor. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az A-faktor termelésére nem képes S. griseus B2682-AFN törzs egy nonszensz mutációval rendelkezik az afsR génben, amely ezen protein kináz útvonal A-faktor termelés szabályozásában betöltött szerepét feltételezi. Azt bizonyítandó, hogy valóban az afsR mutációval magyarázható az AFN törzs A-faktor defektusa, célul tűztük ki ezen törzs, egy funkcióképes afsR változattal való transzformálását. Ennek érdekében a S. griseus vad típusú törzséből izolált DNS templátként való felhasználásával az afsR gént PCR-rel amplifikáltuk. A klónozáshoz az alacsony kópiaszámú pHJL401 és a magas kópiaszámú pWHM3 Streptomycesekben és Escherichia coliban is fenntartható ingázó plazmidokat választottuk. A PCR terméket XbaI és EcoRI restrikciós enzimekkel való hasítását követően az ugyanezen enzimekkel megvágott plazmidokba ligáltuk. Mivel a Streptomycesek kifejezetten rossz transzformációs hatékonysággal rendelkeznek, a ligátumokat az E. coli TOP10 törzsébe transzformáltuk a hősokk módszert követve. A pHJL401-afsR és pWHM3-afsR plazmidokat felvett transzformánsokat ampicillint tartalmazó LB táptalajon szelektáltuk. A klónokból a plazmidokat alkalikus lízissel visszaizoláltuk, majd a későbbi Streptomyces transzformálás hatékonyágát növelendő az E. coli ET12567 törzsbe transzformáltuk. Az ezen törzsből visszaizolált plazmidokat használtuk fel a S. griseus AFN törzsének transzformálásához, melyet protoplasztálást követően PEG1000 jelenlétében végeztük. A továbbiakban céljaink között szerepel a thiostrepton rezisztencia segítségével szelektált transzformánsok ellenőrzése és fenotípusos jellemzése.