pSUPER alapú shRNS konstruktok létrehozása

A rövid, duplaszálú RNS molekulák (siRNS-ek) bevitele számos organizmusba a génkifejeződés gátlását idézi elő az RNS interferencia jelenségét kihasználva.
Munkám során olyan vektor konstruktokat hoztam létre, melyek humán és egér NRF1, NRF2, AMPK génekre specifikus, géncsendesítésre alkalmas oligonukleotidokat tartalmaznak. Ehhez egy pSUPER RNS interferencia rendszert használtam, mely tartalmaz egy olyan emlős expressziós vektort, amely siRNS molekulák intracelluláris szintézisét teszi lehetővé. A génspecifikus szekvenciákat irodalmi adatokból illetve a Broad Institute, TRC shRNS könyvtárának adatbázisából gyűjtöttük ki. Az oligonukleotidok tervezését a Serial Cloner szoftver segítségével végeztük el. A vektorba ligáláshoz alkalmas teljes szensz oligonukleotid tartalmaz egy BglII hasítóhelyet, a génspecifikus szakaszt, egy hurok régiót, a génspecifikus szakasz reverz komplementerét és egy polyT farok régiót. A teljes antiszensz oligonukleotid szekvenciája ennek pontosan a reverz komplementere, egy 5’ végi Hind III hasítóhellyel. A két egyenként 64 bázisból álló oligonukleotidot egymáshoz hibridizáltatva hoztuk létre a ligálásra alkalmas inszertet. A pSUPER plazmidot BglII és HindIII restrikciós enzimekkel hasítottuk és T7 ligáz enzim segítségével végeztük el az inszert ligálást a linearizált plazmidba. A rekombináns plazmiddal DH5α kompetens sejteket transzformáltunk és ampicilin tartalmú táptalajon növesztettük őket. A pozítív klónok keresésére EcoRI/HindIII kettős emésztést alkalmaztunk. A kész konstruktok tranziens és stabil transzfekcióhoz egyaránt alkalmasak, a target gén funkcionális inaktiválását eredményezve.
Ezen konstruktokat egér és humán emlőrák sejtekbe szeretnénk transzfektálni és vizsgálni, hogy a mitokondriáls homeosztázisban szerepet játszó gének csendesítése különböző kezelések mellett milyen funkcionális változásokat okoz ezen sejtekben.