Ubikvitinszerű fehérjék konjugáglása transzglutamináz enzimek által

Ismereteink bővülésével az utóbbi két évtizedben az ubikvitináció egyszerű fehérjelebontási szignálból általános poszttranszlációs módosító folyamattá lényegült át, melynek keretében egy kis fehérje C-terminális glicinjén keresztül kovalensen kapcsolódik más fehérjék lizil oldalláncaihoz. A módosított fehérjét ubikvitin (Ub)-kötő domént hordozó fehérjék ismerik fel, és meghatározzák az ubiquitinált fehérje sorsát. Az ubikvitin-szerű fehérjék (Ubl) az Ub-hez a szekvencia szintjén változó mértékben homológ, hozzá szerkezetileg nagyon hasonló (ún. ubiquitin-fold) apró proteinek, melyek hasonló kapcsolási mechanizmussal módosítanak célfehérjéket és lipideket. Mára több mint tíz ilyen fehérje ismert.
Az ubikvitináció és az Ubl-konjugáció három enzimet igényel (E1/2/3), melyek N’-ε-(α-Gly)-Lys izopeptid kapcsolódást hoznak létre. Munkacsoportunk eredményei arra utalnak, hogy transzglutaminázok (TGM) képesek az Ub-t egy lépésben fehérjékhez kapcsolni. A TGM-ok több szempontból az E1/2/3 enzimekhez hasonlóan működő, de Ca2+-függő acil-transzferázok, amelyek fehérjék Gln és Lys oldalláncai között N’-ε-(γ-Glu)-Lys izopeptid keresztkötéseket teremtenek. Az Ub és az Ubl-ek rendkívül hasonló kapcsolási mechanizmusának ismeretében indokoltnak gondoltuk, hogy megvizsgáljuk, valamely TGM képes-e Ubl fehérjéket is használni szubsztrátként.
Ennek érdekében 293T sejtekből, illetve humán vér eredetű mononukleáris sejtekből RNS-t izoláltunk, cDNS-be írtuk át, és specifikus primerek segítségével amplifikáltuk a SUMO1, az ISG15, a NEDD8 kódoló szekvenciáit és a pETDuet-1 prokarióta expressziós vektorba illesztettük őket. A MAP1LC3B-t kódoló cDNS-t egy eukarióta expressziós vektorból helyeztük át a pETDuet-1-be. Új konstrukcióink birtokában a négy Ubl fehérjét E.coli Rosetta2 baktérium törzsben fejeztük ki, és a 6xHis peptid-tag segítségével Ni+-NTA gyantán tisztítottuk. A rekombináns Ubl fehérjéket és a szintén baktériumban termelt TGM-okat használva in vitro vizsgáljuk, hogy a TGM család valamely tagja képes-e kötést létrehozni az Ubl-ek és ismert amin-, vagy acil- TGM-szubsztrátok között, illetve igyekszünk sejtek lizátumában célfehérjéket találni és tömegspektrometriával azonosítani.