Alfavírus proteáz szubsztrátok helyspecifikus mutagenezisére és expressziójára alkalmas rendszer optimalizálása

Nyomtatóbarát változatNyomtatóbarát változat
Konferencia: 
2012/2013. tanév
Tagozat: 
Molekuláris biológia
Előadó szerző adatai
Név (format for foreign students: Last Name, First Name): 
Bordán Zsuzsanna

Előadás adatai

Előadás címe: 
Alfavírus proteáz szubsztrátok helyspecifikus mutagenezisére és expressziójára alkalmas rendszer optimalizálása
Összefoglaló: 

Az alfavírusok a togavírusok családjába tartozó, burokkal körülvett mRNS vírusok, melyek állatállományok és az emberek körében is okoznak fertőzéseket, szerte a világon. Kiválthatnak agyhártyagyulladást, valamint hozzájárulhatnak kóros ízületi gyulladás-szerű tünetek kialakításhoz is. Életciklusukban központi szerepet játszik egy nem-szerkezeti fehérje (nsP2), mely proteolitikus aktivitással rendelkezik. Laboratóriumunk már tanulmányozta három alfavírus családból származó nsp2 proteáz aktivitását oligopeptid szubsztrátokon. Megállapítottuk, hogy a vad típusú nsp2 proteázok az eredeti szubsztrátokon csak kis aktivitással rendelkeznek. Célunk egy olyan enzim-szubsztrát pár kiválasztása volt, amely alkalmas lehet biotechnológiai felhasználásra, ezen kívül a kísérletek során gyűjtött információk fontosak lehetnek antivirális terápia kidolgozásához is. Annak érdekében, hogy előnyösebb szubsztrátokat azonosíthassunk, egy olyan rekombináns fehérjét terveztünk, mely alkalmas lehet a szubsztrátok fúziós formában történő expressziójára és módosítására. A konstrukcióban az oligopeptid szubsztrát N-terminális végénél egy hat hisztidines szekvenciát követően egy maltózkötő fehérje van, a fehérje tisztításának megkönnyítésére és oldékonyságának megnövelésére. A C-terminális véghez egy fluoreszcens fehérjét kapcsoltunk, ezáltal megkönnyítve a detektálást. A szubsztrátszekvenciák kicserélése a konstrukcióban, egy restrikciós kazettában lehetséges. Az expressziós plazmid, mérete miatt (>8Kb) nem megfelelő a szubsztrátszekvenciák random mutagenezissel történő módosítása, ezt egy kisebb, mutagenezisre alkalmasabb plazmidban végeztük. Az így módosított szubsztrátszekvenciát restrikciósan kihasítjuk a mutagenizált plazmidból és az expressziós plazmid restrikciós kazettájába inzertáljuk. Ezen tanulmányban kívánjuk részletesen bemutatni az optimalizált rendszert, valamint bizonyítani, hogy ez a fúziós forma megfelelő-e a módosított alfavírus szubsztrátok termelésére.

1. témavezető adatai
Név: 
Dr. Tőzsér József
Intézet / Tanszék/ Klinika: 
Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet
2. témavezető adatai
Név: 
Bozóki Beáta
Intézet / Tanszék/ Klinika: 
Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet

Támogatók: Támogatók: Az NTP-TDK-14-0007 számú, A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése helyi konferencia keretében, az NTP-TDK-14-0006 számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása, NTP-HHTDK-15-0011-es A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése 2016. évi helyi konferencia keretében, valamint a NTP-HHTDK-15-0057-es számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása című pályázatokhoz kapcsolódóan az Emberi Erőforrás Támogatáskezelő, az Emberi Erőforrások Minisztériuma, az Oktatáskutató és Fejlesztő Intézet és a Nemzeti Tehetség Program