BEVEZETÉS. Az endotél sejtek az erek belső falán konfluens monolayert alkotnak. Egyik legfontosabb funkciójuk a vér és a szövetek közötti barrier képzés. A TIMAP (TGF-β-inhibited membrane associated protein) fehérje magas expressziós szintje figyelhető meg endotéliumban más sejttípusokhoz képest. Immunfluoreszcens festéssel a fehérjét az endotél sejtek magi, illetve membrán régiójában találtuk. Korábban munkacsoportunk kimutatta, hogy a TIMAP a protein foszfatáz 1 enzim regulátoraként részt vesz az endotél barrier szabályozásában. Szerkezetében megtalálható a foszfatáz kötéséért felelős PP1c-kötő motívum, ankirin ismétlődések, egy nukleáris lokalizációs szignál és egy prenilációs motívum.
Előzetes eredményeink szerint, az eEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1) fehérje szintén kölcsönhat a TIMAP-pal. Az eEF1A1 a transzlációban betöltött szerepe mellett részt vesz a fehérjék nukleáris exportjában. Pull down módszer felhasználásával a TIMAP 165-290 aminosav részletét tartalmazó régióját, melyben a nukleáris exporthoz szükséges TD-NEM motívum is megtalálható, a kölcsönhatás kialakításában azonosítottuk. Célunk a motívum mutációjával igazolni a TD-NEM jelentőségét a TIMAP-eEF1A1 kölcsönhatásában.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK. A TIMAP fehérje mutánsainak bakteriális expressziójához szükséges pGEX4T-3 konstruktokat PCR és szubklónozási lépésekkel állítottuk elő, majd BL21 sejtekbe transzformáltuk. A rekombináns TIMAP változatokat glutation-Sepharose 4B-hez kötöttük, majd endotél sejtlizátummal inkubáltuk. Az eEF1A1 kötődését az eluált minták Western blot vizsgálatával vizsgáljuk.
EREDMÉNYEK. Sikeresen előállítottuk a vadtípusú TIMAP trunkált és annak TD-NEM motívumban módosított formáját. A fehérjék termelését optimalizáltuk. A baktérium kezdeti eredménytelen feltárásából adódó nehézségeket szarkozilt tartalmazó lízis puffer alkalmazásával tudtuk megoldani. Ezzel a módosítással sikerült a baktériumból a fehérjék kinyerése, illetve kikötésük a glutation-Sepharose 4B-hez. Az eEF1A1 fehérje TIMAP mutánsokhoz való kötődésének kimutatása még folyamatban van.