A miozin foszfatáz szerepe a SNAP25 fehérje szabályozásában
Előadás adatai
A neurotranszmisszió folyamatában nagy fontossággal bír a szinaptikus fehérjék foszforiláció általi szabályozása. A fehérjék foszforilációs szintjét a protein kináz és foszfatáz enzimek határozzák meg. Az egyik szabályozó elem a szinaptikus vezikulák kibocsátásában szerepet játszó SNARE komplex, amely szintaxin, szinaptobrevin és SNAP25 fehérjék komplexeként a szinaptikus membrán és a vezikula kapcsolatát hozza létre. A szinaptobrevin, és szintaxin közötti kapcsolatért felelős SNAP25 számos foszforilációs hellyel rendelkezik, melyek befolyásolhatják a fehérje működését. Ezeket az aminosav-oldalláncokat számos protein kináz, így például a PKC, vagy a PKA foszforilálhatja. A fehérje defoszforilációját katalizáló foszfatáz enzimekről, illetve más protein kinázokról nem rendelkezünk részletes ismeretekkel. Előzetes kísérleteink alapján a preszinapszisban a Ser/Thr PP1 enzimcsalád tagjai közül csupán a MYPT1 szabályozó alegységből és protein foszfatáz 1 katalitikus alegységből (PP1c) álló miozin foszfatáz (PP1M) holoenzim van jelen. Ezért célunk a SNARE komplex PP1M általi szabályozásának vizsgálata volt. A B50 neuroblastoma sejtvonalban igazoltuk a PP1M alegységeinek jelenlétét, illetve a MYPT alegységének asszociációját a PP1c izoformáival és a neurotranszmisszióban fontos SNARE komplex elemeivel. Sikeresen csendesítettük a PP1M MYPT1, illetve PP1 alegységeit, és a teljes protein foszfatáz enzimaktivitás 30%-os csökkenését tapasztaltuk. A PP1M-csendesített B50 sejtekben a SNAP25 Ser187 oldallánc emelkedett szintű foszforilációját mutattuk ki foszfospecifikus antitestekkel. A SNAP25 mutagenezisével SNAP25S187A és foszforilációs helyet mimikáló SNAPS187E mutánsokat hoztunk létre. A vad típusú és mutáns plazmidokkal transzfektált tsa sejtekből SNAP25 fehérjéket tisztítottunk és foszforilációs kísérleteket végeztünk. Mivel a PP1M által defoszforilált szekvenciát a Rho A aktivált kináz (ROK) foszforilálhatja, ezért az expresszált fehérjéket ROK kinázzal foszforiláltuk, és a PP1M rekombináns enzimmel defoszforiláltuk. Eredményeink arra utalnak, hogy a SNAP25 a ROK/PP1M enzimpár neuronális szubsztrátjai, és a SNAP25S187 foszforilációs szintjének szabályozásával az idegsejtek neurotranszmitter kibocsátását szabályozza.
Támogatók: Támogatók: Az NTP-TDK-14-0007 számú, A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése helyi konferencia keretében, az NTP-TDK-14-0006 számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása, NTP-HHTDK-15-0011-es A Debreceni Egyetem ÁOK TDK tevékenység népszerűsítése 2016. évi helyi konferencia keretében, valamint a NTP-HHTDK-15-0057-es számú, A Debreceni Egyetem Népegészségügyi Karán folyó Tudományos Diákköri kutatások támogatása című pályázatokhoz kapcsolódóan az Emberi Erőforrás Támogatáskezelő, az Emberi Erőforrások Minisztériuma, az Oktatáskutató és Fejlesztő Intézet és a Nemzeti Tehetség Program