A HOFI/SH3PXD2B (Homologue of FISH) egy membrán asszociált adapter, amely egy N-terminális phox-homology (PX) domént és négy tandem SH3-domént tartalmaz. Saját munkánk és más kutatócsoportok korábban publikált adatai alapján ismert, hogy a fehérje különböző az aktin citoszkeleton szabályozása alatt álló struktúrák, mint például lamellipódiumok, podoszómák és invadopódiumok kialakításához nélkülözhetetlen. Ez felveti a HOFI szerepét a transzformált sejtek migrációjának és a metasztázisok kialakulásának szabályozásában. Kísérleteinkben az A2058 humán melanóma sejtvonal felhasználásával tanulmányoztuk a HOFI sejt proliferációra gyakorolt hatását.

A HOFI expresszió megszüntetésére két plazmidot használtunk, amelyek a HOFI gén két eltérő régiójára specifikus shRNS-eket expresszáltak. Kontrolként olyan plazmidokat használtunk, amelyek shRNS szekvenciájában négy nukleotidot megváltoztattunk. Ezt követően független HOFI-negatív és kontrol sejtklónokat szinkronizáltunk 0,1%-os FBS tartalmú médiumban való éheztetéssel, majd normál szérum-koncentráció (5% FBS) mellett vizsgáltuk a sejtek proliferációs képességét. A különböző időpontokhoz tartozó sejtszámot Bürker-kamra segítségével határoztuk meg. HOFI jelenlétében magasabb proliferációs rátákat kaptunk.

A géncsendesítéses kísérletek utolsó fázisa a gátolt gén rekonstitúciója az adott kísérleti rendszerben. A HOFI-expresszió rekonstitúciója vad típusú mRNS-t expresszáló vektorokkal nem sikerült, ezért készítettünk egy olyan plazmidot, amiben az siRNS célszekvenciát három pozícióban módosítottuk. A nukleotidokat a kodonok harmadik pozíciójában változtattuk meg így az aminosav-sorrend változatlan maradt. Ezeket a plazmidokat tranziensen transzfektáltuk 293T sejtekbe és bizonyítottuk, hogy a „mutáns” plazmidok rezisztensek a sejtek által expresszált shRNS-ekre. Ezután a plazmidokat stabilan transzfektáltuk A2058 sejtekbe. A sejtek karakterizációja jelenleg folyamatban van.

Összességében megmutattuk, hogy a HOFI A2058 sejtekben a sejtproliferáció pozitív regulátora és létrehoztunk számos eszközt amelyek segítségével felfedhetjük a tumor sejtvonalakban a HOFI sejtnövekedésre gyakorolt hatásának molekuláris mechanizmusát.