A glükóz anyagcsere útvonalában szerepet játszó fehérjék génjeinek mutációi okozhatnak hipoglikémiát és monogénes diabetest is. A monogénes diabetes esetén a tünetek az adott mutációtól függően jelentkezhetnek a neonatális periódusban vagy fiatal felnőttkorban (MODY, maturity-onset diabetes of the young). A monogénes diabetes genetikai vizsgálatok során gyakran korábban nem ismert mutációt detektálunk.
Célkitűzés. Vizsgálataink célja a glükokináz (GCK) génben detektált új mutációk funkcionális vizsgálata a patogenitás igazolása céljából.
Anyag és módszer. A GCK gén E.coli glutathion S-transzferáz (GST) fúziós expressziós vektorba klónozott kódoló régióját vad típusú formájában expresszáltuk. A rekombináns fehérjét (rhGCK) tisztítottuk. SDS-PAGE analízist végeztünk a fehérje tisztaságának megállapítására. A rhGCK aktivitását és ATP Km értékét meghatároztuk. Helyspecifikus mutagenezissel létrehoztuk a p.Gly72Ala, p.Asp124Val és p.Ala173Asp misszensz mutációkat, melyeket DNS szekvenálással ellenőriztünk.
Eredmények. A vad típusú hGCK-t GST fúziós formában magas tisztaságban sikeresen előállítottuk. A rhGCK csúcsfrakcióinak aktivitása (42,3, 15,3 és 4,4 kU) jól korrelált a fehérje mennyiséggel. A vad típusú enzim ATP Km értéke 0,768 mM. A mutánsok előállítása sikeres volt, a DNS szekvenálás minden esetben igazolta a mutáció létrejöttét.
Konklúzió. A klinikai genetikai vizsgálatok nehézsége az ismeretlen jelentőségű variánsok interpretációja, hiszen a genetikai eredmény klinikai döntéshozatalt von maga után. Kísérleti rendszerünkben a korábban betegekben talált mutációk funkcionális tesztelését tűztük ki célul a GCK esetében. A vad típusú rhGCK előállítása nyomán a betegekben talált új GCK mutációk rekombináns rendszerben történő vizsgálata lehetségessé vált. A fenti kísérleti rendszer a beteg (klinikum) - genetikai diagnosztikai - genetikai/biokémiai kutató laboratórium - beteg útvonalon tudományos bizonyítékok alapján képes választ adni a klinikumban felmerülő kérdésekre.